一、蛋白与多肽
蛋白质与多肽具有相同的氨基酸骨架
→ 一般来讲，分子量超过10,000的称为蛋白，小于10,000的称为多肽。但其实即使这种分类也还是模糊的。
蛋白质因为折叠具有特殊的空间构造。
→ 酸性或碱性溶液可以破坏这样的构造而使蛋白失活
→ 使用温和以维持蛋白活性的检测条件非常必要
多肽分子尺寸越小，其获得特殊空间构造越困难
→ 比起蛋白分离，多肽分离条件的选择自由度大（可使用有机溶剂）
→ 环状多肽还是有些特殊立体构造的（特殊多肽的个别应用）
多肽是α-氨基酸的α位氨基和羧酸脱水缩合而成的产物
→ 在末端有未反应的氨基、羧基存在
→ 所以有N末端、C末端的叫法
→ 在记述氨基酸序列时，N末端在左侧、C末端在右侧（因此，Lys-Arg和Arg-Lys是不同的多肽）
二、多肽医药品与其他医药品的比较
低分子化合物 | 经典多肽 | 特殊环状多肽 | 抗体** | |
分子量 | 1,000以下 | 500-6,000 | 600-2,500 | 150,000以上 |
活性 | 普通~高 | 高~极高 | 极高 | 极高 |
特异性 | 低 | 高 | 极高 | 极高 |
PPI*阻碍 | 困难但可能 | 可能 | 可能 | 可能 |
血中稳定性 | 低~普通 | 极低~低 | 普通~高 | 极高 |
口服 | 可以 | 几乎不可以 | 可以*** | 不可以 |
毒性・副作用 | 多 | 少 | 少 | 少 |
细胞内靶点 | 可 | 几乎不可 | 可 | 不可 |
生产成本 | 低 | 低~普通 | 低~普通 | 高 |
* 蛋白与蛋白间的相互作用
** 完整抗体，不含Fab、scFv等
*** 取决于分子量或环状多肽Linker的大小
三、多肽的色谱分离条件
1. 多肽的分离常使用中性--酸性流动相
2. 碱性条件下，可能会发生：
Asn/天冬氨酰（有时候Gln/谷氨酰胺也是）脱胺
Asp/天冬氨酸 → isoAsp
S-S交换反应
3. 下列色谱分离模式更多使用中性--酸性流动相
反相色谱（RPC）
离子交换色谱（IEC）：尤其是阳离子交换色谱（CIEC）
尺寸排阻色谱（SEC）
正相色谱（NPC・HILIC）
亲和色谱（AFC：尤其是金属螯合亲和色谱（IMAC）
四、TSKgel尺寸排阻色谱柱在多肽分离分析中的应用
尺寸排阻色谱（SEC）：利用色谱填料的细孔径、基于分析物尺寸大小达成分离的模式。
※ 选择排阻界限在10000以下的SEC色谱柱
TSKgel UP-SW2000, SuperSW2000, G2000SWXL, TSKgel G2500PWXL, etc.
※ 优势
色谱条件单纯，利于品质管理的使用。
根据分子量（尺寸）大小可以预判洗脱位置。
※ 缺点
样品可进样量相对较小。
分析物可能会与固定相（色谱填料）发生疏水相互作用（→ 添加有机溶剂）。
※ 流动相推荐
流动相：0.1 % TFA＋ 45% 乙腈（0.1 % TFA非必须）。
同种流动相，含有蛋白组分时蛋白的空间构造被破坏，分子呈伸展状态（变性），这时候进行分子量表征时，使用100 %水溶液条件下标准蛋白校正曲线不合适。
含0.1 % TFA的流动相分析疏水性高的多肽时，如果洗脱较迟，可以推荐使用醋酸溶液等。
色谱柱 | 粒径 | 多肽/蛋白分子量排阻范围 | 特点 |
TSKgel UP-SW2000 | 2 μm | 100 - 100000* | 分辨率最高、排阻范围宽 |
TSKgel G2000SWXL | 5 μm | 100 - 100000* | 分辨率高、排阻范围宽 |
TSKgel SuperSW2000 | 4 μm | 100 - 100000* | 分辨率高、排阻范围宽 |
TSKgel G2500PWXL | 7 μm | 100 - 5000 | 适用于低分子量多肽、耐碱 |
TSKgel G3000PWXL | 7 μm | 1,000 - 50000 | 适用于高分子量多肽、耐碱 |
参考谱图
