第158期 --使用东曹TOYOPEARL Sulfate-650F填料纯化九因子（凝血因子Ⅸ）

 凝血因子是血浆与组织中直接参与凝血的物质的统称。其中已按国际命名法，用罗马数字按发现的次序编号的凝固因子有12种（原13种，VI其实是活化后的第五因子而被取消）：凝血因子I，II，III，IV，V，VII，VIII，IX，X，XI，XII，XIII。此外，还有前激肽释放酶、激肽释放酶，以及来自血小板的磷脂等。因子XIII以后被发现的凝血因子，经过多年验证，认为对于凝血功能，无决定性的影响，不再列入凝血因子的编号。因子VI事实上是活化的第五因子，已经取消因子VI的命名。除了Ca²⁺和磷脂外，其余已知因子都是蛋白质，多具有酶的特性，在血液中处于无活性状态，以保持血液的液体性。只有被激活后才有凝血作用。通常于因子名称后加“a”，以示其为活化状态，如II→IIa。多数凝血因子在肝脏合成且需维生素K参与。九因子（凝血因子IX）的学名为凝血酶原复合物全名冻干人凝血酶原复合物，俗称九因子，为人体血浆制品，主要用于治疗乙型血友病。

离子交换色谱（IEC）因吸附量较大，被广泛应用于血浆蛋白的粗纯工艺。但是离子交换色谱容易受到样品中盐浓度的影响，如果样品溶液中含盐，则除了过滤以外，还需要进行脱盐、透析等前处理。但是，近几年市面上出现了一种不易受到盐浓度影响的耐盐型（salt-tolerant）离子交换填料，可以作为一种混合模式填料用于这类样品的纯化。

最近发表在期刊《Biotechnology Journal》上的一篇文献中，研究人员使用了东曹的耐盐型阳离子交换填料TOYOPEARL Sulfate-650F，从凝血酶原复合物浓缩液（PCC）中有效纯化凝血因子IX（Factor IX，九因子）。

M. Begić et al., Salt-tolerant cation-exchanger containing sulfate groups as a viable alternative for mixed-mode type and heparin-base affinity resin, Biotechnol. J., 2021; 2100100, CC BY NC ND, https://doi.org/10.1002/biot.202100100

一、TOYOPEARL Sulfate-650F的简介

1. 带有硫酸根官能团的阳离子交换填料

• 官能团为硫酸根(SO4-) ,与S-、SP-和CM-等类型相似，同为阳离子交换填料。

• 对抗体等蛋白有很高的吸附载量。

2. 可有效去除抗体中的多聚体

• 相较于其他阳离子交换填料，对多聚体有着更高的分离效果。

• 在pH低于5.0、并含有0.15 mol/L的NaCl缓冲液中仍然可以结合抗体，具有耐盐性。

• 可作为Protein A层析的后续纯化步骤。

3. 有类似于肝素亲和填料的分离纯化效果

• 可以应用于AT-III和其他相关蛋白的分离纯化。

• 有望应用于病毒和疫苗的分离纯化。

4. 适用的缓冲液pH范围

• 一般可以用于pH 4-12的缓冲液中。

• 可以用pH 3-13的清洗液进行短时间的CIP处理。

二、TOYOPEARL Sulfate-650F的基本参数

出货溶剂：含0.2mol/L醋酸钠的20%乙醇溶液

三、TOYOPEARL Sulfate-650F适用样品

• 单克隆抗体

• 血浆蛋白、凝血因子

• 病毒、VLP、疫苗

• 重组蛋白

• 碱性蛋白

四、TOYOPEARL Sulfate-650F的主要特点

• 高载量

• 多聚体分离

• 耐盐的阳离子交换填料

• 与肝素亲和作用相似（硫酸根官能团）

五、TOYOPEARL Sulfate-650F的应用条件

1. 单克隆抗体多聚体的分离纯化

• 对IgG可达到100 g/L的高载量。

• 可以作为Protein A亲和层析的后续纯化步骤。

2. 在pH 5 以下具有耐盐性

• 在pH 4.7、0.15 mol/L NaCl的缓冲液中可以对样品进行吸附。

• 在Protein A 亲和层析或前处理后可以直接进行上样。

3. 硫酸根官能团的特异性相互作用

• 与肝素亲和层析相似，可以与凝血因子、疫苗或病毒结合。

• 可以用0-1 mol/L的NaCl进行盐梯度洗脱。

• 与竞争对手的Sulfate填料具有类似的吸附性能，但是Sulfate-650F具有更高的吸附载量（某些填料由于孔径小，所以蛋白只能结合在填料的表面）。

4. 常用的分离条件

• 上样缓冲液的pH要控制在5.5以下。

• 优化缓冲液的pH和盐浓度能够获得更好的分离效果。

• 当缓冲液的pH为4.2时，即使在0.3mol/LNaCl的缓冲液中也能够获得很高的吸附载量。

六、凝血因子IX的纯化实例

下图是使用耐盐型阳离子交换填料TOYOPEARL Sulfate-650F分离PCC中的维生素K依赖性凝血因子的结果。

首先，使用含有0.4 mol/L NaCl的高盐浓度洗脱液，让吸附较弱的凝血因子II、因子VII、因子X不被填料吸附直接流穿。然后，通过降低盐浓度和提升pH的阶梯梯度洗脱，把吸附在柱子上的因子IX洗脱下来。使用Sulfate-650F无需对样品进行脱盐处理，即可获得与使用肝素亲和层析相同纯度的因子IX。

七、TOYOPEARL Sulfate-650F在类似于肝素亲和填料方面的应用展望

1. 类似于肝素亲和填料的分离纯化作用*

• 凝血因子：Factor VII、Factor IX、Factor X、凝血酶、AT-III

• 组织纤溶酶原激活物(TPA）

• 脂肪酶、核酸酶有关（如限制性内切酶）、胶原酶、脂蛋白

2. 利用硫酸根官能团的相互作用*

• 病毒、疫苗

八、订货信息

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