寡核苷酸的HPLC分析方法
治疗性寡核苷酸是由固相化学合成工艺生产。在合成过程中会产生工艺相关杂质和产品相关杂质。产品相关杂质包含许多目标产物的类似物（分子量的差别：碱基数N-1、N、N+1等），磷酸基S化等的不对称化合物、异构体等。因此，杂质的分析监控对工艺和质量控制就显得十分重要。液相色谱技术具有样品适用范围广、分离效率高、速度快等特点，已成为核酸药物生产与质控分析必不可少的重要手段。
图1 寡核苷酸的磷酸化及糖基修饰
磷酸化修饰：空间配置引起的异构体（但都是有效成分）
糖基修饰：通过架桥增强对核酸酶的耐受和降低毒性（如吗琳环型）
碱基修饰：适配体立体构造的多样性
表1 寡核苷酸分离常用的HPLC分离模式及适用的TSKgel色谱
分离模式 | 分离原理 | 特长及用途 | 适用的色谱柱 |
尺寸排阻色谱（SEC） | 分析物的分子尺寸大小 | 1.可以使用接近生理条件的洗脱溶液进行分离 2.基于碱基数不同分离（Mw） 3.用于质量控制或纯度含量分析
| TSKgel UP-SW系列 |
TSKgel SWXL系列 | |||
TSKgel PWXL系列 | |||
TSKgel G-DNA-PW系列 | |||
离子交换色谱（IEC） | 分析物与固定相间的离子相互作用 | 样品载量高 | TSKgel DNA-NPR
|
可以根据磷酸基的数量分离样品（N-1, N, N+1 ）
| TSKgel DNA-STAT | ||
反相色谱（RPC） | 分析物与填料间疏水性 相互作用 | 分辨率高 结构异构体、不对称体的分离 | TSKgel Oligo DNA-RP |
TSKgel ODS-100V | |||
TSKgel Super-ODS | |||
亲水作用色谱（HILIC） | 分析物与填料间亲水性 相互作用 | 增强HILIC-ESI-MS质谱检测灵敏度 （不加离子对试剂条件下） 结构异构体、不对称体的分离
| TSKgel Amide-80 2μm |
应用实例
质粒的HPLC分析方法
随着基因治疗和DNA疫苗的迅速发展，高纯度的质粒DNA的需求量越来越大。药物级质粒DNA必须要符合宿主相关杂质、均一性方面的要求。因此，在质粒纯度检测时，需要区分出超螺旋、开环和线型三种拓扑异构体质粒。
表2 质粒分离常用的HPLC分离模式及适用的TSKgel色谱柱
分离模式 | 分离原理 | 特长及用途 | 适用的色谱柱 |
尺寸排阻色谱（SEC） | 分子尺寸大小 （质粒分子较大，在排阻V0附近洗脱） | 用于质量控制或纯度含量分析 | TSKgel G6000PWxl TSKgel G-DNA-PW |
离子交换色谱（IEC） | 电荷的差异 （质粒带高负电荷） | 分离质粒拓扑异构体 | TSKgel DNA-NPR |
疏水色谱（HIC） | 疏水性的差异 | 分离质粒拓扑异构体 | TSKgel Butyl-NPR |
应用实例
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