有人问到：“我的工艺是流穿模式，是否需要评价柱效？”还有人问到：“我的工艺是亲和层析，单梯度洗脱，不用担心拖尾，是否需要评价柱效？”今天，小编为大家进行统一解答。
什么是柱效？
柱效（column efficiency），是指层析柱保留某一物质而不使其扩散的能力。柱效越高，则分离度越高。
塔板理论及柱效评价标准
马丁（Martin）和欣革（Synge）最早提出塔板理论，将层析柱比作蒸馏塔，把一根层析柱设想成由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间为固定相占据，另一部分空间充满流动相。组分随流动相进入层析柱后，就在两相间进行分配。并假定在每一小段内组分可以很快地在两相中达到分配平衡，这样一个小段称作一个理论塔板（theoretical plate）。经过多次分配平衡，分配系数小的组分先离开蒸馏塔，分配系数大的组分后离开蒸馏塔。
理论塔板数（N）计算公式：
该公式中的Ve，必须从进样时起算。
每米理论塔板数（N/m）=理论塔板数（N） ÷ 柱床高度。
HETP（height equivalent of theoretical plate），理论塔板等量高度，即每一层理论塔板的高度。
简单来说，每米理论塔板数，是指每米有多少层；HETP，是指每一层有多高。可以说两者是互为倒数的关系。
评价标准：一般情况下，认为HETP ＜4倍粒径大小即为比较理想的柱效。比如装填平均粒径90 μm的Sepharose填料，则要求HETP ＜360 μm，通过计算，要求每米理论塔板数 ＞2778。或可根据实际情况，将柱效标准定为每米理论塔板数 ≥3000。
对称性，也称峰不对称因子（Asymmetry, As），用来评价层析柱装填的均匀程度。
As =b/a。As ＞1，说明装填偏松，表现为峰拖尾；As ＜1，说明装填偏紧，表现为峰前沿。若对分离度有较高要求，可把标准定为0.8 ＜As ＜1.2；若对分离度要求并不高，可把标准定为0.8 ＜As ＜1.5，甚至更宽的范围。
是否一定要评价柱效？
总体来说，还是建议进行柱效评价的，但柱效评价标准不能一概而论。
高标准：1）分子筛层析；2）反相层析；3）疏水层析；4）采用阶性梯度或线性梯度洗脱的离子交换层析。此类层析对分离度有较高要求，有些需要采用多梯度洗脱或线性洗脱，如果柱效不佳，往往会造成峰扩散或拖尾，会对纯化效果产生很大影响。建议标准：HETP ＜4倍粒径，0.8 ＜As ＜1.2。
低标准：1）亲和层析；2）采用单梯度洗脱的离子交换层析。此类层析仅需采用单梯度洗脱，有时在产物洗脱下来后，还要立即进行稀释，以防产物聚集，因此对分离度要求较低。然而，过于严重的峰扩散和拖尾，也是会影响纯化效率的，因此柱效测定也必不可少。建议标准：HETP ＜5倍粒径，0.8 ＜As ＜1.5。
仅要求峰型及对称性：流穿模式。此类模式为目标产物流穿，杂质被吸附，如果填料装填不均匀，或者过于松散，仍会导致吸附不匀而影响载量和处理量。因此，评估柱效时建议观察一下峰型及对称性，如果峰型平滑，且对称性良好，即可接受。建议标准：0.8 ＜As ＜1.5。当然，如果装填工艺稳定，甚至进行了工艺验证，该模式也可以不进行柱效评价。
柱效评价的常见问题及处理
前沿峰
可能原因：压缩过紧。
解决办法：重新装填。
拖尾峰
可能原因：1）压缩过松；2）管路过粗，或检测器流通池体积过大，造成稀释效应。
解决办法：1）重新装填；2）检查管路及检测器流通池规格是否匹配。
低柱效
可能原因：1）沉降不均匀；2）碎填料过多；3）检测器或泵故障。
解决办法：1）降低匀浆浓度，确保搅拌均匀后一次性缓慢倒入层析柱；2）去除碎填料；3）检查检测器及泵是否正常；4）考虑更换为粒径更细的填料以提高柱效，如TOSOH聚合物基材填料（http://www.prep-hplc.com/brand/view/1.html）。
峰型不佳
可能原因：1）柱床中心凹陷，或柱床与筛网之间存有气泡，导致样品流动不均匀（样品需要绕过凹陷区或气泡）；2）装填不均匀，甚至内部有裂缝；3）筛网堵塞，导致样品流动不均匀；4）层析柱无分配器，或分配器设计不佳，导致偏流。
解决办法：1）重新装柱，优化装柱策略；2）拆卸、清洗筛网，并确认筛网孔径是否合适；3）采用具有合理分配器设计的层析柱。
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