疏水层析是依据蛋白质疏水性差异分离的。即根据蛋白质和疏水介质表面的疏水基团的可逆相互作用进行分离。疏水力在高离子强度下被增强，因此在高离子强度环境中结合，通常采用降低离子强度的方式进行洗脱。独特的吸附分离模式使得疏水层析成为硫酸铵盐析后或离子交换高盐洗脱后理想的纯化方式。

疏水相互作用层析（HIC）是纯化生物分子工艺中一个功能强大的工具。该技术利用蛋白表面疏水区域和固定相弱疏水性基团之间的相互作用进行层析分离。HIC是离子交换和尺寸排阻层析法的很好的补充，尤其是样品中存在蛋白异构体，或目标样品与杂质的等电点或分子量相似而难以分离时使用。在亲和填料不易分辨识别位点相似的蛋白时，HIC通过选择性的差异可以在亲和层析之后使用。

生物分子表面大都含有或强或弱的疏水区域，在不同环境下，与各种疏水介质产生不同的强弱和结合。高离子强度可加强疏水性。和离子交换刚好相反，高盐吸附，低盐洗脱。经洗脱样品又可直接或稍加稀释后上其它层析柱，作为连接下游和层析步骤的桥梁。并可完全取代传统的盐析沉淀技术，更符合工业生产要求。 比反相层析介质的配体密度低很多，无需有机溶剂洗脱，保存生物活性。配体种类繁多，提供宽广的选择性。疏水层析的分离效果受不同配体、缓冲液、盐浓度、温度等多种因素影响。哪种介质最适合很难预测，必须经过试验。