第135期 东曹色谱产品在质粒DNA纯化与分析中的应用
质粒（plasmid）是一种小型环状DNA，在基因工程中常利用质粒作为运载体，将目的基因转移到受体细胞内。虽然近年来开发了不少更为先进的基因转移载体（如慢病毒载体、腺病毒载体、AAV载体等），但质粒载体由于制备简便以及在各类细胞中的高效转染率，仍然被大多数实验室使用。
随着基因治疗的迅速发展，高纯度的质粒DNA的需求量越来越大。在纯化质粒DNA时，除了需要去除混入的蛋白质、RNA、内毒素和宿主基因组DNA等杂质以外，还需要去除质粒DNA的立体异构体Open circular体（开环状质粒）和Linear体（直链线状质粒），只对Supercoiled体（超螺旋状质粒）进行纯化。
质粒的色谱分离模式
分离模式 | 分离方法 | 分离原理 | 去除杂质 | 纯化步骤 |
尺寸排阻色谱 （SEC） | 等度分离 | 分子尺寸的差异 （质粒分子较大，在排阻V0附近洗脱） | 延迟洗脱 | 初期粗纯 精制 |
阴离子交换色谱 （AIEC） | 吸附/梯度洗脱 | 电荷的差异 （质粒带高负电荷） | 流穿或梯度 （质粒异构体分离） | 捕获 中间步骤 精制 |
疏水色谱 （HIC） | 流穿 吸附/梯度洗脱 | 疏水性的差异 | 疏水性的差异 （质粒异构体分离） | 捕获 中间步骤 |
Ref.: Palmieri et al., BioProcess International, 2011, Lonza webinar, modified
使用阴离子交换色谱分析质粒DNA
基因治疗实验中质粒纯度的检测方法之一是测量开环质粒和超螺旋质粒的相对量。下图是采用阴离子交换色谱柱TSKgel DNA-NPR分析质粒的谱图。此款色谱柱采用无孔的亲水聚合物基质填料，表面由弱阴离子交换基团改性，具有极高的蛋白回收率。适用于对DNA片段，PCR产物及质粒的高效分离。
质粒的纯化工艺步骤示例
在质粒DNA的纯化工艺中通常使用阴离子交换层析、疏水层析和尺寸排阻层析。质粒DNA与内毒素相比，其疏水性非常低，所以使用疏水填料可以从质粒DNA中有效去除内毒素。
Ref.: S.Palmieri et al., BioProcess International, 2011, Lonza webinar, modified
使用Toyopearl Butyl-650S疏水填料纯化质粒
使用TSKgel和TOYOPEARL分离纯化质粒载体的应用实例
分离模式 | 色谱柱 | 应用 | 文献名称 |
SEC IEC,HIC | TSKgel G-DNA-PW、 G6000PWXL、 DNA-NPR、Butyl-NPR | 质粒DNA | Characterization of Plasmid DNA Samples by Chromatographic Methods |
IEC | TSKgel DNA-NPR | 质粒DNA | Separation of topological forms of plamid DNA by anion-exchange HPLC: Shifts in elution order of linear DNA |
SEC | TSKgel G-DNA-PW、 G6000PWXL | 质粒DNA | High-speed chromatographic purification of plasmid DNA with a customized biporous hydrophobic adsorbent |
IEC | TSKgel DNA-NPR | 质粒DNA | Effective and robust plasmid topology analysis and the subsequent characterization of the plasmid isoforms thereby observed |
分离模式 | 层析填料 | 应用 | 文献名称 |
AFC | 精氨酸固定化 AF-Epoxy-650M | 超螺旋质粒DNA | Effect of Chromatographic Conditions on Supercoiled Plasmid DNA Stability and Bioactivity |
HIC | Butyl-650M | 质粒DNA | Improved downstream process for the production of plasmid DNA for gene therapy |
