大麻二酚（cannabidiol，CBD）可用于治疗多种病症及缓解疼痛。最近，FDA批准了一种高纯度CBD制剂（Epidiolex）用于治疗癫痫。从大麻植物中提取的CBD粗提物含有大量其它物质，包括精神活性物质四氢大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC），由于THC在大多数国家是受管控的，因此纯化CBD时必须要求将THC降低至100-1000 ppm。传统的CBD纯化方法，即单柱层析，是以牺牲CBD收率为代价将THC含量降低至该水平的，浪费了大量目标产物。通过Multi-column Counter-current Solvent Gradient Purification（MCSGP，多柱逆流溶剂梯度纯化）可有效解决该问题，能够分离出高纯度、高收率、高产量的目标产物，且纯化效率显著优于单柱层析。本文阐述如何从预处理的大麻植物提取物中获得高纯度CBD，并将THC含量降低至要求范围内。
介 绍
在大麻二酚（CBD）的生产中，THC及其它植物性杂质（如蜡质和色素）很难去除，需要经过一系列的预处理和纯化步骤，才能从大麻中提取获得高纯度、低THC含量的CBD产品。
从大麻提取物中纯化CBD需要进行预处理，包括植物的粉碎、干燥、CO2提取、脱羧和蒸馏、层析和结晶。为了将大麻相关杂质（主要是THC）降低至100 ppm，必须采用层析方法。提取物中的蜡质和其它杂质会对层析填料造成污染，所以必须在层析之前通过预处理将这些杂质去除干净。大麻素类物质的水溶性较差，需要采用反相层析进行纯化，相关工艺的有机溶剂用量很大。一些杂质与CBD产品出峰有重叠部分，分离具有挑战性。采用单柱层析，需要在纯度和收率之间做出权衡，两者此消彼长，若要获得高纯度的CBD，通常收率都很低。如何在获得高纯度的产品的同时，保证高收率，是该工艺所面临的难点。
MCSGP原理
Multi-column Counter-current Solvent Gradient Purification（MCSGP）是采用双柱进行连续纯化，可以解决单柱层析时纯度和收率无法同时保证的问题。
采用MCSGP，可将含有不纯组分的产品回收再纯化， 进行循环式的层析操作，从而最大限度地提纯产品， 使得纯度和收率二者兼得。
图1. 传统单柱层析（左）：重叠组分被舍弃；MCSGP（右）：重叠组分被在线回收，再次纯化。
材料和方法
工艺步骤：大麻是在室内受控环境下生长的，需对大麻进行采摘、干燥、预处理和纯化。
图2. CBD工艺步骤
层析样品：
层析的上样样品是蒸馏液和甲醇的混合物，CBD纯度为85.2%，浓度为250 g/L。该结果通过Agilent 1100型高效液相，采用C8反相柱测得，测定波长为230 nm，标准进样量为10 μL。经测定，上样样品中的THC含量为4.8%（48,000 ppm）。
图3. 上样样品分析图谱
层析纯化：
同时采用单柱层析和双柱MCSGP纯化CBD，测定280 nm处紫外吸收值。层析柱内径10 mm，柱床高度150 mm，柱床体积11.9 mL，装填介质为C18反相填料。每次上样体积为0.37 mL。以70% B进行等度洗脱，洗脱流速305 cm/h（即4 mL/min），洗脱时长90 min。洗脱完毕后进行层析柱清洗。所有操作均在室温（25℃±3℃）进行。该条件下，层析柱的反压为50 bar。
单柱层析结果
层析过程图谱见图4和图5。分段收集洗脱产物，并进行液相分析（图5）。
图4. C18纯化CBD过程图谱，显示UV280 nm、CBD浓度、THC含量（THC含量在10min左右开始显著升高）
图5. 层析过程图谱局部放大，显示目标物（CBD）和主要杂质浓度
MCSGP设计
MCSGP采用与单柱工艺相同的层析柱、溶剂及基本工艺参数。
图6. MCSGP工艺设计流程图
STEP 1：根据分段收集及液相分析结果，对单柱层析图谱进行区域划分设计（图7）。
图7. 单柱层析图谱进行区域划分设计
A：CBD浓度2.7 g/L（2,000 mAU）时开始进行回收（recycle）；
B：CBD浓度13.3 g/L（10,000 mAU）时开始收集目标产物（product）；
C：紫外值降低至最大峰值90%时结束收集目标产物，并再次开始回收；
D：6 min后，结束回收。
STEP 2：设定层析柱规格及上样量。MCSGP所用2根层析柱的规格与单柱层析完全相同。
STEP 3：设定基本工艺参数。MCSGP基本工艺参数与单柱层析完全相同。
STEP 4：设定cycle次数，MCSGP向导软件自动显示上样总量，自动生成StartUP及ShutDown方法。如因环境条件（温度等）造成出峰漂移等，可选择开启MControl过程控制功能，保证工艺稳定性。
MCSGP向导软件可自动计算回收阶段的在线稀参数，并可显示所需进料的总体积、溶剂和运行时间等。
MCSGP操作
为了优化MCSGP工艺，在不同的操作条件下进行了多次运行，对产品洗脱区和回收区的划分进行了细微调整，最终确定出最佳条件，并以该条件运行MCSGP。图8显示了最终用于CBD纯化的MCSGP运行图谱，总计运行了8个cycle，由图可见cycle重现性良好。
图8. MCSGP运行图谱，总计运行8个cycle。该图仅显示柱1的UV变化，蓝色
和绿色区域为回收区，位于蓝色和绿色之间的红色区域为目标产物收集区。
图9. MCSGP各cycle的叠加图谱
图9各cycle重叠性良好，表明MCSGP功能运行稳定，各cycle的产率、产品浓度及纯度均保持稳定。保留时间和峰形的变化由MControl自动补偿，MControl根据紫外线阈值启动CBD收集，当紫外值降低至最大峰值90%时结束收集。
使用分析液相测定MCSGP每个cycle洗脱产物（2个/cycle，每柱各1个）的纯度和产物浓度。图10显示，CBD产品的纯度大于99.5%。
图10. MCSGP纯化所得CBD液相分析图谱
单柱层析与MCSGP的对比
从收率、纯度、产率、产品浓度和溶剂消耗等方面对单柱层析和双柱MCSGP进行了计算和比较，MCSGP在各方面均表现出明显优势。
图11. 纯度 - 收率曲线
图11为单柱层析与MCSGP收率对比图。已规定最大THC含量为100 ppm，在这一水平，单柱层析的CBD收率仅为52%，而MCSGP的CBD收率为94%，比单柱层析高出80%。
图12. 纯度 - 产率曲线
MCSGP可用于不同工艺要求。如果对目标产品的纯度要求并不高，采用MCSGP可使产率进一步提高。比如某企业要求THC含量上限为1000 ppm时，收率水平不得低于85%，用MCSGP代替单柱层析后，产率由原来的8 g/L/h提高到了60 g/L/h以上。而另一工艺情况为，当从单柱层析转换为MCSGP时，保持产率不变，杂质THC含量可从1000 ppm降低至100 ppm。见图12纯度 - 产率曲线。
图13. 纯度 - 溶剂消耗曲线
图13显示了单柱层析和MCSGP的溶剂消耗对比。在要求THC最大含量为1000 ppm时，MCSGP可使溶剂消耗量降低30%。单柱层析的溶剂消耗量为每mL上样样品消耗95 mL溶剂，而MCSGP的溶剂消耗量仅为每mL上样样品消耗65 mL溶剂。
总结
与单柱层析相比，MCSGP在大麻二酚（CBD）的纯化和杂质THC的去除方面具有明显优势。主要包括：
1. 在THC含量要求100 ppm时，MCSGP可使CBD收率提高80%左右；
2. 在THC含量要求1000 ppm时，MCSGP可使产率提高7.5倍左右；
3. 在THC含量要求1000 ppm时，MCSGP可使溶剂消耗量降低30%。
溶剂消耗量的减少可显著降低溶剂采购成本、溶剂再生/处理成本，并减少制备和储存溶剂所需的占地面积。
MCSGP的每个cycle仅收集2次（per cycle / per switch），而单柱层析过程的各组分需要分段收集、送检，因此采用MCSGP，可使HPLC检验工作量显著降低。
通过MCSGP提高产率，可应用于多种生产方式：
1. 可采用更小规格的层析柱，在相同的时间内，完成与单柱层析相同的生产任务；
2. 可采用与单柱层析相同规格的层析柱，在更短的时间内完成生产任务；
3. 层析介质体积相同时，可在相同时间内获得更多的产品。
层析系统介绍
Contichrom HPLC：Contichrom HPLC是一套多用途的制备型实验室级层析系统，可运行多种单柱和双柱模式。ChromIQ是Contichrom系统的操作软件，其中包括MCSGP向导功能。
EcoPrime Twin HPLC ：EcoPrime Twin HPLC为生产型连续流层析系统，可在GMP条件下运行MCSGP功能，满足MCSGP工艺的有效线性放大。
北京慧德易专注于层析领域十余年，现与瑞士ChromaCon公司强强联合，将世界领先的Contichrom双柱连续流层析技术引进中国，并已于2017年在北京昌平生命科学园蛋白质药物国家工程研究中心成立慧德易实验室&培训中心，现已成功举办多期连续流技术培训班。
北京慧德易实验室&培训中心可为广大客户提供工艺开发、产品展示及培训服务，欢迎广大客户莅临指导！
微信扫一扫“二维码”，即可添加关注我们的微信号，了解更多慧德易活动信息及产品信息！
北京慧德易科技有限责任公司
层析系统、制备液相、分析液相、实验仪器
层析填料、大孔树脂、色谱柱子、项目服务
010-59812370/1/2/3
www.prep-hplc.com
